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育龙网核心提示: 作者:袁成录,史春雷,王玲,李颖,黄梅娟,王媛媛,高岱清关键词造血干细胞移植;,,外周血干细胞;,,冻存方法摘要:目的:探求一种操作简

作者:袁成录,史春雷,王玲,李颖,黄梅娟,王媛媛,高岱清

关键词造血干细胞移植;,,外周血干细胞;,,冻存方法

摘要:目的:探求一种操作简便实用、造血干细胞回收率和存活率高、成本低的外周血造血干细胞的冻存方法。方法:CP-1和5%白蛋白作保护剂在80℃条件下直接冻存,并检测冻存前后外周血干细胞的活性,单个核细胞和CFU-GM、CD34+细胞的回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性,单个核细胞和CFU-GM、CD34+细胞的回收率无明显差异,输注后造血均重建。结论:CP-1和5%白蛋白作保护剂在80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法,具有广泛的临床推广价值。

关键词:造血干细胞移植;外周血干细胞;冻存方法

StudyontheFreezingProceduretoStorePeripheralBloodStemCellsat-80℃

Abstract:Objective:Toseekaconvenient,practicalfreezingprocedurewithhighrecoveryrateandsurvivalrateaswellaslowcosttostoreperipheralblood(PB)stemcells.Method:ThePBstemcellswerefrozeat80℃directlywithCP-1and5%albuminasprotectiveagents.TheactivityofPBstemcellsandrecyclerateofmononuclearcell(MNC),CFU-GMandCD34+cellsbeforeandafterfreezingweredetected.Result:TheactivityofPBstemcellsandrecoveryrateofMNC,CFU-GMandCD34+cellshavenosignificantdifferencesbeforeandafterfreezing.Hemopoiesiscouldbereconstructedafterinfusionall.Conclusion:Freezingstemcellsdirectlyat80℃byusingCP-1and5%albuminasprotectiveagentsisaconvenient,reliable,safeandlowcostproceduretostorePBstemcells,whichhasthepossibilitytobeusedinclinicalwidely.

Keywords:Bloodstemcelltransfusion;Peripheralbloodstemcells;Freeze-saving

以CP-1和5%白蛋白作干细胞保护剂直接80℃冰箱冻存外周血干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法,在造血干细胞移植中已广泛应用。我科为14例病人所做的66次外周血干细胞冻存均采用以上方法,取得良好效果,现报告如下。

1资料与方法

1.1研究对象:2003年10月至2005年10月,进行外周血造血干细胞移植的病人14例,男8例,女6例;年龄13~53岁,平均42.5岁。急性淋巴细胞白血病4例,急性非淋巴细胞白血病4例,非霍奇金淋巴瘤4例,霍奇金淋巴瘤1例,多发性骨髓瘤1例。

1.2外周血造血干细胞动员及采集:所有病人均采用自体外周血造血干细胞移植,采用MAG方案动员。米托醌8~10mg/×2d,阿糖胞苷2g/×3d,当联合化疗后白细胞下降到最低开始回升时应用粒细胞集落刺激因子,5~10μg/kg/d皮下注射,当白细胞>5.0×109/L时开始采集,应用CS-3000细胞分离机采集外周血干细胞,血循环量为10l/次,采集次数为1~2次,获得外周血干细胞的MNC中位数为4.5(3.0~6.9)×108/kg,CD34+细胞中位数5.2(4.2~18.9)×106/kg,CFU-GM为2.7(1.6~10.9)×105/kg。

1.3外周血干细胞冻存:用CP-1和20%白蛋白配成冷冻液,与采集的干细胞混合,白蛋白的终浓度均为5%,然后分装于冷冻袋中,留取少许标本送检:胎盼蓝染色、MNC计数、CD34+细胞和CFU-GM检测。平放于冷冻夹中,直接放入-80℃冰箱中保存。

1.4解冻回输:回输前将冷冻袋从-80℃冰箱中取出,立即放入40℃的温水中解冻,保证1min内细胞完全溶解,然后在30min内将解冻的干细胞回输给病人。回输前应用抗组织胺药物和地塞米松预防过敏反应,回输时密切观察病人的生命体征。回输后将冷冻袋中干细胞残留液立即送检:胎盼蓝染色、CD34+细胞和CFU-GM检测。

1.5指标检测:外周血干细胞冷冻前后分别做胎盼蓝染色、MNC计数、CD34+细胞和CFU-GM检测,并比较冷冻前后胎盼蓝染色、MNC计数、CD34+细胞和CFU-GM的数值,计算回收率。

1.5.1胎盼蓝拒染率:用2%胎盼蓝溶液染色,计数100个单个核细胞。

1.5.2MNC计数:用血细胞计数仪测定单个核细胞数量,血片瑞氏染色油镜分类,计数单个核细胞的比例。

1.5.3CD34+细胞数量:应用流式细胞仪进行CD34+细胞的测定。

1.5.4CFU-GM测定:采用琼脂办固体培养,5%CO2培养箱培养10d,计数集落数量。

1.6外周血干细胞造血重建:自体外周血干细胞回输后中性粒细胞、血小板恢复时间。即中性粒细胞>0.5×109/L的天数,血小板不输注情况下,血小板>20×109/L的天数。干细胞回输后14d和28d分别做骨髓检查。

1.7统计学分析:本文结果中资料以±S表示,以t检验进行统计学处理。

2结果

2.1外周血干细胞冷冻前和解冻后胎盼蓝拒染率、MNC、CFU-GM、CD34+细胞的结果见表1。

表1外周血干细胞的冻存效果

P<0.05

2.2外周血干细胞回输时情况:14例病人回输66袋干细胞,回输过程中未发生寒战、发热、呼吸困难等不良反应。

2.3自体外周血干细胞回输后中性粒细胞、血小板恢复时间。中性粒细胞>0.5×109/L的天数平均13.5d,血小板不输注情况下,血小板>20×109/L的天数平均12.2d。

2.4外周血干细胞的冻存时间:外周血干细胞的冻存时间是指自冷冻开始到解冻后的天数,我们为14例病人所做了66次外周血干细胞冻存,平均冻存时间为81.2d。

2.5我们为14例病人所做的外周血干细胞冻存,回输后均造血重建。比较冷冻前和解冻后胎盼蓝染色、MNC计数、CD34+细胞和CFU-GM等数值,都无统计学差异。

3讨论

造血干细胞的冻存是自体造血干细胞移植成功的关键技术之一,造血干细胞的冻存效果的高低直接影响到移植的成功率。既往供认的干细胞的冻存方法是10%二甲基亚砜,-196℃液氮保存,此方法可长期保存干细胞[1]。但此方法也有些缺陷:①需要程序降温设备、液氮罐等设备,保存费用高;②10%的DMSO浓度高,输注过程会出现恶心、呕吐、心律失常等副作用,解冻时已形成凝块导致干细胞回收率降低;③冷冻程序繁琐,不宜推广。1983年Stiff[2]等采用-80℃冰箱冻存骨髓干细胞获得成功。Lionetti[3]报道采用4%的羟乙基淀粉和5%DSMO冻存干细胞可有较好的回收率。国内报道[4]采用终浓度5%DMSO、3%HES和4%的白蛋白作为干细胞的保护剂-80℃直接冻存外周血干细胞,从检测到不同时像干细胞的回收率来看,在9个月内冻存干细胞的活性,MNC、CFU-GM、CD34+细胞的回收率与冻存一个月无差异。

我们采用CP-1、5%白蛋白作为干细胞的保护剂,-80℃冰箱直接冻存外周血干细胞,共为14例病人进行66例次干细胞冷冻,冷冻前和解冻后干细胞的活性,MNC、CFU-GM、CD34+细胞的回收率无差异。14例自体外周血造血干细胞移植病人均获得重建造血。干细胞在输注过程中未出现恶心、呕吐及心律失常等不良反应。

采用CP-1、5%白蛋白作为干细胞的保护剂,-80℃冰箱直接冻存外周血干细胞方法简便实用,需要的设备简单,冷冻费用低,轻易把握和推广。

参考文献:

[1]达万明,裴雪涛.外周血干细胞移植[M].北京:人民卫生出版社,2000.97.

[2]StiFFPJ,MurgoAJ,ZaroulisCG,etal.Unfractionatedhumanmarrowcellcryopreservationusingdiemethylsulfoxideandhydroxyethylstarch[J].Cryobiology,1993,20:17.

[3]LionettiFJ,HuntSM,GoreJM,etal.Cryopreservationofhumangranulocyte[J].Cryobiology,1975,12:181.

[4]彭贤贵,陈幸华,刘林,等.-80℃条件下不同浓度外周血干细胞冻存效果的实验观察[J].重庆医学,2003,32:132.