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育龙网核心提示: 符合一下条件的大鼠入选缺血模型组:①动脉夹闭60s内,大鼠翻正反射消失;②持续双侧瞳孔开大,角膜反射消失;③肛温监测,稳定在37±0.3℃;


符合一下条件的大鼠入选缺血模型组:①动脉夹闭60s内,大鼠翻正反射消失;②持续双侧瞳孔开大,角膜反射消失;③肛温监测,稳定在37±0.3℃;④脑电图呈接近基线的低平的电波动或近似直线。

手术前晚大鼠禁食,自由饮水,戊巴比妥钠(40mg/kg体重)腹腔注射大鼠进行麻醉。将大鼠仰卧固定在手术台土,作颈前正中切口,切开皮肤及皮下组,仔细分离出双侧颈总动脉,并分别套以丝线(仅用作标记,不结扎),术中注重不损伤血管及血管四周的迷走神经和颈交感干。将颈前切口缝合后再将大鼠俯卧位固定于手术台上,作颈后正中切口,分离肌肉后暴露双侧第一颈椎横突上的翼孔,用双极电凝器插入翼孔烧灼,永久阻断双侧椎动脉,缝合切口。24h后于动物清醒状态下将大鼠直接仰卧固定于手术台上,拆开颈前正中切口缝线,用动脉夹同时钳夹双侧颈总动脉15min后松开动脉夹,剪断丝线,确认双侧颈总动脉再灌后关闭切口。手术过程中进行持续肛温监测,并用白炽灯照射的方法使大鼠肛温稳定在36.7~37.3℃范围内。

假手术组动物仅灼烧双侧椎动脉,但不夹闭双侧颈总动脉,其余步骤同缺血组。正常组大鼠不予任何处理。

2.5.2海马组织的样本制备:实验动物均于3h、12h、24h、72h、7d快速断头处死,于生理盐水冰面上快速取出大脑,置于冰生理盐水中快速冲洗,用滤纸吸干水分,生理盐水冰面上快速分离取出双侧海马组织,并迅速置入冻存管,快速液氮冷冻后再置于-70℃冰箱待测。

2.5.3MDA含量检测:测定时取出海马样本,低温环境下电子天平精确称重,再置入EP管中,取9倍重量的生理盐水,超声波细胞粉碎机制成10%(重量/体积)的组织匀装。严格按照试剂盒说明书操作。

方法:硫代巴比妥酸法。公式::组织MDA含量=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10nmol/ml)÷蛋白含量(mgprot/ml)。

2.5.4SOD活性检测:测定时取出海马样本,低温环境下电子天平精确称重,再置入EP管中,取9倍重量的生理盐水,超声波细胞粉碎机制成10%(重量/体积)的组织匀浆。严格按照试剂盒说明书操作。方法:黄嘌呤氧化酶法。公式:[(对照管吸光度一测定管吸光度)/对照管吸光度]÷50%×(反应液总体积/取液量)÷组织中蛋白含量

2.6统计学处理:实验数据均采用±s表示,并采用spss10.0软件对数据中各组之间进行one-wayANOVA统计学分析。

3结果

3.1小鼠急性脑缺氧实验:结果显示,正常小鼠断头后呼吸时间在21s左右,不同剂量的丹参水溶性成分均可延长断头小鼠的呼吸时间,与正常对照组比较差异显著(P0.05或P0.01)。

3.2小鼠耐化学性缺氧实验:结果显示,不同剂量的丹参水溶性成分均可延亚硝酸钠中毒小鼠的生存时间,与空白对照组比较差异显著(P0.05或P0.01)。

表1丹参水溶性成分对小鼠断头呼吸的影响(略)

与正常组比较:P0.05,P0.01

3.3大鼠海马MDA含量变化:结果显示:各采样时相MDA含量①与假手术组比较,模型生理盐水组MDA含量均明显升高,12h达到高峰并随再灌注时间的延长而逐渐降低,7d时仍高于假手术水平;②模型丹参组可显著降低各采样时相MDA的含量,并于再灌注72h降至假手术组水平。

表2丹参水溶性成分对小鼠化学性缺氧死亡时间的影响(略)

与正常组比较:P0.05,P0.01

表3大鼠海马MDA含量变化(略)

与假手术组比较:#P0.05,##P0.01;与NS组比较:P0.05,P0.01

3.4大鼠海马SOD活性检测:结果显示:各采样时相SOD活性:①与假手术组比较,模型生理盐水组SOD活性明显降低,至7d时SOD活性回升至假手术组水平;②模型丹参组可显著提升各采样时相SOD活性,并于72h达假手术组水平。

表4大鼠海马SOD活性变化(略)

与假手术组比较:#P0.01;与NS组比较:P0.01

4讨论

4.1丹参的水溶性成分:丹参的化学成分主要分为脂溶性和水溶性两类。水溶性成分主要是原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等[7]。

4.2丹参水溶性成分对脑缺血缺氧刺激的保护作用:缺血缺氧对机体是一种劣性刺激,影响机体的氧化供能,导致机体心、脑等重要器官能量衰竭而死亡。断头造成脑血供给中断,但脑中原有的血和营养物质尚能使脑功能维持一段时间,丹参的水溶性成分可使脑组织耐缺氧能力增强,脑功能维持时间延长,从而延长小鼠喘息时间。小鼠亚硝酸钠致死实验中,丹参的水溶性成分能延长小鼠的生存时间,提示其可能具有提高机体的血氧利用率,降低机体的耗氧量,从而提高组织利用氧的能力,延长因缺氧造成的氧供能力不足的动物的生存时间。即丹参的水溶性成分对组织代谢具有调节及保护作用。

4.3丹参水溶性成分对神经细胞生物氧化的保护:氧化应激是缺血性脑损伤的重要机制。DNA是细胞内氧自由基最主要的攻击对象。因此认为,脑缺血再灌注后的氧化损伤可促使细胞凋亡。本研究结果显示,与生理盐水组对比,丹参组使海马组织SOD活性增强,MDA含量降低,减轻了自由基的损伤。因而证实丹参的抗凋亡作用通过降低自由基损伤而实现。

综上所述,丹参水溶性成分的神经保护作用可通过增加脑组织的耐缺氧能力、提高机体的血氧利用率,降低机体的耗氧量和降低自由基损伤等多个途径而实现。

参考文献

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,2002.478-482.

[2]杨春欣.丹参素的药理研究进展[J].中国药理学通报,1997,13(4):298-301.

[3]张荣泉,王德仁,张蓉.丹参水溶性成分提取工艺研究[J].中药材,2001,24:818-819.

[4]李卫平,明亮,张艳,等.黄芪多糖耐缺氧作用的实验研究[J].安徽医科大学学报,1995,30:184-185.

[5]张明霞,赵惠,胡拥军,等.红花对小鼠抗应激能力的影响[J].中国中医药信息杂志,1999,6:26-27.

[6]PulsinelliWA,BuchanAM.Thefour-vesselocclusionratmodel:methodforcompleteocclusionofvertebralarteriesandcontrolofcollateralcirculation[J].Stroke,1988,19(7):913-4.

[7]中国医学科学院药物研究所.中草药现代研究[M].北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1996.472.